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摘要:

研究背景与目的:对抗癌免疫反应的全面理解对癌症免疫疗法的最佳应用和发展至关重要。我们通过高维分析揭示了结直肠癌(CRC)患者的局部和全身免疫特征,以提供CRC免疫状况的无偏见的表征。

研究方法:对35个CRC组织、26个与肿瘤相关的淋巴结、17个结直肠健康黏膜和19个来自31例CRC患者的外周血样本,通过质谱流式(CyTOF)在单细胞水平同时评估了36种免疫细胞标记物。此外,通过流式细胞仪,单细胞RNA测序和多光谱免疫荧光对肿瘤浸润淋巴细胞进行功能、转录组和空间分析。

研究结果:我们发现先前未曾了解的先天性淋巴细胞群体(Lin-CD7+ CD127- CD56+ CD45RO+)在CRC组织中富集,并显示出细胞毒性活性。该亚群表现出组织驻留(CD103+ CD69+)表型,并且在免疫原性错配修复(MMR)缺陷的CRC中最丰富。它们在肿瘤中的存在与具有高度相似的活化表型(HLA-DR+ CD38+ PD-1+)的肿瘤驻留细胞毒性T细胞、辅助T细胞和γδT细胞的浸润相关。值得注意的是,活化的γδT细胞几乎仅在MMR缺陷型癌症中发现。在CRC和健康的粘膜组织中存在未激活的肿瘤驻留细胞毒性T细胞和γδT细胞对应物,但在肿瘤阳性淋巴结除外。

研究结论:这项工作为理解CRC的多样化的和复杂的免疫学图谱提供了一个蓝图,包括鉴定以前未认识到的免疫细胞亚群。肿瘤固有的先天性和适应性免疫细胞群的同时存在表明可能可以利用这些免疫细胞的抗肿瘤特性开发多靶点的治疗策略。

摘要:

低危骨髓增生异常综合征(MDS)患者的骨髓通常是炎性环境,并伴有活跃的细胞免疫反应。活化的免疫反应通常有助于抗肿瘤反应,并可以预防疾病进展,然而,慢性免疫刺激也可诱导细胞应激,DNA损伤并促进MDS的发病。因此,针对过度免疫激活的保护机制是MDS病理生理学的重要方面,对其进行表征可能有助于我们更好地了解低风险疾病中保护性和不稳定的炎症之间的良好平衡。

在这项研究中,我们研究了血栓调节蛋白(CD141 / BDCA-3)表达(一种具有抗炎特性的分子)在不同风险组的MDS患者的骨髓和外周血中的单核细胞上的作用。患者来源的经典单核细胞显示血栓调节蛋白的高表达水平,而来自健康供体的单核细胞几乎不表达任何血栓调节蛋白。MDS患者单核细胞上血栓调节蛋白的存在与较低风险的疾病组以及更好的总体生存率和无白血病生存率相关。

在体外环境中,使用多维的质谱流式细胞技术,我们发现血栓调节蛋白阳性单核细胞可以使na?ve T细胞朝着更接近Th2和Treg表型的细胞簇极化,并且不太可能有助于有效的免疫监测。总之,血栓调节蛋白在经典单核细胞上的表达是低危MDS患者的有利和早期预后标志物,可能代表了针对过度免疫激活的新机制。

摘要:

质谱流式细胞技术(CyTOF)可以在单细胞水平同步分析多种细胞蛋白已经被应用于肿瘤内和肿瘤间的异质性研究。这个技术也可能被用于研究个体肿瘤对治疗响应的多样性。

在本文中,我们基于AXL信号作为潜在的靶向策略对肺肿瘤亚群进行了分层。整合转录组分析研究TP-0903(一种AXL激酶抑制剂)如何影响转移性肺癌细胞中多余的致癌途径。

CyTOF分析显示,AXL的抑制会抑制SMAD4 /TGFβ信号传导,并诱导JAK1-STAT3信号传导来补偿AXL的丢失。有趣的是,在未经治疗的肿瘤中,高JAK1-STAT3与AXL水平升高有关。具有高AXL、TGFβ和JAK1信号传导的肿瘤在晚期患者中同时显示CD133介导的癌干性和上皮-间充质混合过渡特征,提示远距离传播的潜力更大。

Diffusion pseudotime分析揭示了与每个患者的临床病理特征相关的四个不同类别之间的细胞命运轨迹。从具有高AXL和JAK1的肿瘤获得的患者类器官(PDO)对TP-0903和ruxolitinib(JAK抑制剂)治疗敏感,支持了CyTOF的发现。这项研究表明,未经治疗的肺部肿瘤的单细胞蛋白质组学分析以及PDO的离体测试可在某些可能被AXL-JAK1联合抑制靶向的肿瘤中鉴定出连续的AXL、TGFβ和JAK1-STAT3信号激活。

研究意义:临床样品的单细胞蛋白质组分析可能有助于优化新药靶标的选择、早期临床试验数据的解释以及对患者分级的有价值的预测性生物标志物开发。

摘要:

使用免疫检查点抑制剂(ICIs)的免疫疗法可在许多转移性癌症中诱导持久反应。转移性葡萄膜黑色素瘤(mUM)通常发生于肝脏,是ICIs最难治的肿瘤之一,预后不良。原发性葡萄膜黑色素瘤(pUM)中的Monosomy 3(M3),polysomy 8q和BAP1丢失与不良预后相关。pUM和周围mUM中存在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),以及对过继TIL转移的临床反应的一些证据,强烈表明,尽管UMs突变负荷低,但它们确实具有免疫原性。抑制pUM和mUM中TIL的机制尚不清楚。

我们的研究显示BAP1丢失与抑制性免疫反应相关的几个基因的上调相关,其中一些建立了免疫抑制轴,包括HLA-DR、CD38和CD74。此外,通过质谱流式(CyTOF)对pUM进行单细胞分析,证实了这些标记和其他标记的表达,揭示了浸润性免疫细胞在UM中的重要功能,其中大部分是调节性CD8+ T淋巴细胞和与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)。

肝mUM的转录组分析显示,与pUM具有BAP1丢失(包括IDO1的表达)相似的免疫特征。在蛋白质水平上,我们观察到mUM周围的纤维化区域中包裹着的TAM和TILs上的IDO1,PD-L1和β-catenin(CTNNB1)的表达增加,提示肿瘤驱动的免疫排斥和免疫治疗耐药性。这些发现有助于理解BAP1-mUM中免疫应答的组织方式,这将进一步实现对检测到的生物标志物功能的验证以及关注的免疫治疗方法的发展。

摘要:

巨噬细胞在动脉粥样硬化的发病机理中起主要作用。许多研究揭示了巨噬细胞在暴露于局部环境后可以获得的不同表型和功能。动脉粥样硬化斑块的微环境含有大量的巨噬细胞控制因子,例如细胞因子,氧化的低密度脂蛋白和细胞碎片。以往的研究主要通过免疫组织化学和bulk分析确定了斑块内的巨噬细胞功能。

单细胞技术的最新发展和快速进步,如质谱流式和单细胞RNA测序,现在我们可以对动脉粥样斑块中存在的多种细胞类型及其表型进行全面的分析。

在这篇综述中,我们讨论了将这些技术应用于定义小鼠和人类的动脉粥样硬化动脉壁中的巨噬细胞亚群的最新进展。从这些研究中得出的结果,我们描述了三个主要的巨噬细胞亚群:常驻型,促炎性和消炎性泡沫TREM2hi巨噬细胞,它们在小鼠和人的动脉粥样硬化斑块中均被发现。此外,我们讨论了巨噬细胞亚群特定的marker和功能。对动脉粥样硬化斑块内免疫细胞的特征和表型的更多了解可能会指导未来治疗疾病的临床方法。

摘要:

研究背景与目的:IBD试验期间的肠活检采样是了解组织水平药物反应的有效的辅助策略。考虑到近端结肠和远端结肠的长度和独特的胚胎起源,我们研究了免疫细胞组成的固有区域差异是否可能在取样不同的疾病阶段或在给药前/后引入干扰因素。在这里,我们利用可从患者身上采集的有限数量的活检样本,利用新型的质谱流式细胞技术对不同的健康结肠部分进行了深层免疫表型分析。

研究方法:从正常志愿者的盲肠,横结肠,降结肠和直肠收集活检样本(2.8mm)。分离肠道白细胞,用包含37个金属抗体的Panel染色,并用CyTOF分析。

研究结果:观察到白细胞定位的位点特异性模式。近端结肠的特征是CD8 + T细胞(特别是常驻记忆)、单核细胞和CD19+ B细胞增加。相反,远端结肠和直肠组织表现出CD4+ T细胞和抗体分泌细胞的富集。横结肠显示出γδT细胞和NK细胞的丰度增加。白细胞谱系的亚集也显示沿着结肠长度的表达梯度。

研究结论:我们的结果表明结肠区域内固有的区域免疫细胞多样性,表明在评估疾病阶段或试验药物对白细胞亚群的前瞻性影响时,必须考虑区域黏膜标签特征。必须实施精确的肠采样方案,以正确解释结肠固有层中存在的白细胞谱系中观察到的潜在差异。

摘要:

质谱流式是一种使用金属标签抗体(Abs)进行高维单细胞免疫分析的生物分析技术。目前,基于金属螯合聚合物(MCP)试剂,质谱流式能够在单个细胞上同时检测超过40个参数。但是,随着新的元素标签的发展,质谱流式在原则上能够检测高达135个参数。

本文我们开发了一种基于钽氧化物(TaO2)纳米颗粒(NP)标签,应用于质谱流式免疫分析。通过一锅两步反相微乳液法,我们合成了尺寸均一的胺官能化钽氧化物纳米颗粒(粒径约5.7nm)。通过与叠氮化物-PEG2k琥珀酰亚胺基羧甲基酯(NHS-PEG2k-N3)交联剂反应,这些胺官能化的NPs被叠氮基进一步修饰。随后叠氮化物官能化的NPs与二苯并环辛炔(DBCO)功能化的一级或二级抗体(DBCO-Ab)反应,然后进行快速蛋白质大小排阻液相色谱(FPLC)纯化,最终制备得到Ab-NP偶联物。

制备得到了三种Ab-NP偶联物(TaO2-PEG2k-goat antimouse,TaO2-PEG2k-CD25和TaO2-PEG2k-CD196),并用质谱流式进行了免疫分析。对于TaO2-PEG2k-goat antimouse,我们证明了这一新标签抗体可以有效地检测Ramos细胞CD20 marker的表达量。对于TaO2-PEG2k-CD25和TaO2-PEG2k-CD196,我们也证明了这些Ab-NP偶联物可以整合到商业化的Ab染色Panel中,用于人类外周血单核细胞的高维单细胞免疫谱分析。

摘要:

最近,类器官技术已用于生成大型的乳腺癌类器官库。在这里,我们对类器官培养技术通过正常人类乳腺组织的长期繁殖来保存复杂的干/祖细胞的能力和分化的细胞类型进行了广泛的评估。

基底/干细胞和管腔祖细胞可以在培养中分化以产生成熟的基底和管腔细胞类型,包括在培养中难以维持的ER+细胞。与癌症风险增加相关的细胞也可以增殖。

通过CyTOF对匹配的类器官培养物和天然组织的38种标记物进行单细胞分析,可以用更高的分辨率来表示类器官中的多种乳腺上皮细胞类型,并证明可以在培养物中保留起源组织的蛋白质表达模式。这些研究表明类器官培养物为研究乳腺分化,转化和乳腺癌风险提供了宝贵的平台。

摘要:

研究背景与目的:免疫检查点抑制剂可有效治疗某些肝细胞癌(HCC),但这些肿瘤并不总是对抗PD-1治疗有反应。我们研究了小鼠肝肿瘤对浸润T细胞的抵抗机制。

研究方法:给小鼠流体动力尾静脉注射CRISPR-Cas9和转座子载体来破坏Trp53和过表达Myc(Trp53KO/C-MycOE小鼠)。使用短发夹RNA敲除Hepa1-6细胞中的PVRL1和PVRL3。将Hepa1-6细胞注射到C57BL / 6小鼠的肝脏中,在注射癌细胞之前,对某些小鼠进行了腹膜内注射针对PD1,TIGIT或CD8的抗体。从小鼠收集肝组织,并通过组织学,免疫组织化学和定量实时PCR进行分析。用检测T细胞和其他淋巴细胞的marker,对肿瘤组织进行CyTOF分析。我们从香港接受手术的患者获得了肝癌和非肿瘤肝组织以及临床数据,并通过免疫组织化学分析了组织。

研究结果:Trp53KO/C-MycOE小鼠在3-5周内长出了肝部肿瘤,注射anti-PD-1抗体并未减缓肿瘤的发展。相较于未注射抗体的小鼠,注射了anti-PD-1抗体的小鼠肿瘤存在更多数量的记忆CD8+ T细胞(CD44+CD62L-KLRGint)和表达PD-1,LAG3和TIGIT的T细胞。患者的HCC组织相较于非肿瘤组织,表达更高水平的PVRL1 mRNA和蛋白。PVRL1增加与无病生存时间缩短相关。敲除Hepa1-6细胞中的PVRL1导致它们在小鼠中形成较小的肿瘤,并且肿瘤中浸润更多数量的表达抑制蛋白TIGIT的CD8+ T细胞,在耗竭CD8 + T细胞的小鼠中未观察到这些影响。在Hepa1-6细胞中,PVRL1稳定了细胞表面PVR,该表面与CD8 + T细胞上的TIGIT相互作用,敲除PVRL1会降低PVR的细胞表面水平,但不会降低Pvr mRNA的水平。在Trp53KO/C-MycOE小鼠和患有Hepa1-6细胞生长的肿瘤的小鼠中,注射anti-PD-1和anti-TIGIT的组合可显着降低肿瘤的生长,增加肿瘤中细胞毒性与调节性T细胞的比例,并延长生存期。

研究结论:HCC细胞上调的PVRL1使细胞表面PVR稳定,该表面会与TIGIT相互作用,而TIGIT是CD8 +效应记忆T细胞的抑制分子。这抑制了抗肿瘤免疫应答。可能开发出PVRL1抑制剂,联合anti-PD-1和anti-TIGIT用于治疗HCC。

摘要:

研究背景:慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的特征在于存在病毒性包膜蛋白(hepatitis B surface antigen, HBsAg)缺陷和感染持续时间——大多数患者在出生时或生命的最初几年会被感染。我们研究了这些因素对患者淋巴细胞和HBV特异性T细胞群体的影响。

研究方法:我们收集了来自英国和中国的243例HBV感染(3-75岁)患者的血液样本和临床数据。我们测量了HBV DNA,HBsAg,HBeAg和丙氨酸转氨酶的水平。分析了HBV的基因型和分离的外周血单个核细胞(PBMC)。在来自48位血清HBsAg水平不同的患者的PBMC中,我们通过CyTOF检测了40种自然杀伤细胞(NK)和T细胞的标志物。将189例慢性感染患者和38例已解决感染的患者的PBMC与HBV肽文库一起孵育,并通过干扰素γELISpot分析或流式细胞术鉴定了HBV特异性T细胞。我们使用多元线性回归和赤池信息量准则(Akaike's information criterion)进行变量选择,以识别与T细胞的HBV特异性反应相关的协变量。

研究结果:尽管T细胞和NK细胞的表型和功能并未随血清HBsAg的水平而改变,但是HBs特异性T细胞的数量与血清HBsAg的水平相关(r=0.3367; P < .00001)。在执行变量选择之后,多元线性回归模型将患者年龄确定为与HBs特异性T细胞数量显着相关的唯一因素(P=.000115)。在30岁以下的患者中,HBs特异性T细胞占总HBV特异性T细胞的28.26%。在30岁以上的患者中,该值降低到7.14%。

研究结论:在对来自慢性HBV感染患者的免疫细胞分析中,我们发现是HBsAg暴露的持续时间而不是HBsAg的数量与抗HBV免疫反应的水平有关。尽管并非所有患者都需要存在HBs特异性T细胞来清除HBV感染,但恢复抗HBV免疫反应的策略应考虑30岁以下的患者。

摘要:

研究目的:靶向PD-1/PD-L1途径的免疫检查点抑制剂(ICIs)在肝细胞癌(HCC)中具有临床效应,但是只有一部分患者对这些疗法有反应,这一现象强调了需要新型生物标志物来改善临床疗效。HCC通常发生于慢性乙型或丙型肝炎病毒感染引起的肝硬化,但病毒状态对肿瘤免疫微环境的影响以及对HCC中ICIs的临床反应尚不清楚。

研究方法:我们通过meta分析来评估病毒感染和未感染患者中PD-1 / PD-L1抑制剂的客观缓解率,使用The Cancer Genome Atlas的数据分析了病毒病因对肿瘤微环境的影响,同时使用了质谱流式(CyTOF)对患者外周血反应进行了独立队列研究。

研究结果:meta分析比较了病毒感染患者和未感染患者之间的客观响应率(ORR),发现两个组别间没有临床意义上的差异(感染患者和未感染患者ORR的绝对差值为-1.4%,95%CI: -13.5%—10.6%)。病毒病因学与肿瘤免疫微环境的特征之间没有已知的可以调节对PD-1/PD-L1抑制剂响应的关系,并且病毒感染和未感染的HCC的肿瘤突变负担相似。组织驻留T细胞和B细胞库的RNA测序同样显示病毒状态对其多样性没有影响。外周血样本的CyTOF分析进一步表明,在病毒感染和未感染的HCC中,响应PD-1抑制剂治疗的免疫相关marker的表达相似。

研究结论:病毒病因学对肝癌的肿瘤免疫微环境没有显着影响,并且病毒状态不应该用作选择PD-1 / PD-L1治疗患者的标准。

摘要:

研究背景:世卫组织将SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒病(COVID-19)定义为大流行病。在这里,我们调查了入院时和初始治疗后COVID-19患者的临床表征,细胞因子水平,T细胞比例和相关基因表达。

研究方法:本医院招募了11名诊断为COVID-19且具有相似初始治疗方案的患者。进行了血浆细胞因子,CyTOF和微流体qPCR的分析。

研究结果:入组的11名患者中包括5例轻度和6例重度患者。咳嗽和发烧是11例COVID-2019病例中的主要症状。在高龄患者中,发现中性粒细胞数量在重症患者中增多,并且C反应蛋白水平也升高。IL-10水平随疾病进展和治疗而显着不同。在COVID-19患者中观察到T细胞比例降低,尤其是在严重病例中,在初次治疗后,轻度患者的T细胞比例均升高至正常,但在严重病例中只有CD4+ T细胞恢复正常。DEG的数量随着疾病的进展而增加,而在初始治疗后减少。在严重病例中,所有下调的DEGs主要涉及到Th17细胞分化,细胞因子介导的信号通路和T细胞活化。在对重症患者进行初始治疗后,MAP2K7和SOS1相对于入院时上调。

研究结论:我们的研究结果表明,在COVID-19严重患者中发生了T细胞比例降低以及与T细胞活化和分化相关的基因表达下调,这可能有助于为COVID-19提供有效的治疗策略。

摘要:

    石墨烯是目前研究最热的纳米材料,考虑到石墨烯与人体接触的潜在风险,迫切需要评估石墨烯对人健康的影响。如今,我们已经可以通过高通量的单细胞技术,来深入了解纳米材料的安全性。

    在分析复杂细胞系统的表型和功能方面,质谱流式细胞技术(CyTOF)具有无与伦比的能力,特别是与免疫系统有关的研究。最近也有研究用CyTOF技术证明了石墨烯对免疫系统的影响。接下来的挑战是在单细胞水平追踪石墨烯的分布。

    针对这一问题,本文将氧化石墨烯(GO)经AgInS2纳米晶体功能化(GO-In)后,就可以通过115In通道来分析GO与免疫细胞间的相互作用了。选择金属元素铟(Indium)是为了避免与商业化的CyTOF Panel重叠(>30个免疫marker)。

    作为概念的验证,本文在单细胞水平,利用CyTOF对GO-In与血液免疫细胞亚群的相互作用进行了研究,研究显示GO与单核细胞及B细胞有相互作用,因此可以指导未来的免疫研究。本文提出的方法不仅可以应用于多种石墨烯理化参数的免疫安全性评估,还可以应用于神经科学中的石墨烯应用研究。此外,这种方法可以转化为其他2D新兴材料的研究,促进对其毒理学的了解。

摘要:

    寨卡病毒(ZIKV)是一种新兴的由蚊子传播的黄热病毒,与美洲各地的近期流行病有关,并且与登革热病毒(DENV)密切相关。

    在本文,我们对尼加拉瓜的儿科队列进行了研究,在早期,急性和恢复期几个时间点对46例DENV-naive患者和43例经RT-PCR确诊感染ZIKV的DENV-immune患者进行了研究。我们通过RNA测序(RNA-seq),CyTOF和多重细胞因子/趋化因子Luminex分析,来构建在ZIKV感染期间的先天免疫综合图谱。

    免疫分型和细胞因子/趋化因子分析表明,CD14+单核细胞在ZIKV感染过程中起关键作用。此外,我们将CD14+单核细胞上的CD169(Siglec-1)确定为急性ZIKV感染的潜在生物标记。在所有三个时间点均观察到惊人的转录组和免疫表型特征,有趣的是,已有的登革热免疫力对寨卡病毒的先天免疫反应影响很小。最后,对儿童ZIKV感染进行的全面免疫分析和网络分析可作为后续研究的宝贵资源。

摘要:

    局部晚期转移性尿路上皮癌患者生存率较低(中位15.7个月,13.1-17.8),单药治疗抗PDL1检查点免疫治疗的缓解率仅为23%。为了确定新的治疗靶标,我们使用BBN致癌物分析了鼠类癌症发展过程中的免疫调节特征,并确定了T细胞抑制蛋白B7-H4(VTCN1, B7S1, B7X)表达的增加。

    B7-H4的表达在时间上与淋巴细胞浸润减少有关,虽然人类癌症中,CD11b +单核细胞在膀胱内的B7-H4表达增加,但先前在其他鼠类癌症模型中尚未发现B7-H4表达。B7-H4的较高表达与人类在肌肉浸润性膀胱癌中的生存期较差有关,并且在膀胱癌的管腔和管腔-乳头亚型中发现B7-H4表达增加。

    通过单细胞RNA-Seq和免疫细胞质谱流式(CyTOF)评估人膀胱肿瘤中的B7-H4发现,B7-H4在尿路上皮癌的上皮和肿瘤中的CD68 +巨噬细胞中均表达。为了研究B7-H4的功能,用B7-H4阻断抗体处理人单核细胞和T细胞共培养物,发现会导致CD4 +和CD8 + T细胞的IFN-γ分泌增强。

     此外,抗B7-H4抗体治疗BBN致癌性膀胱癌可使肿瘤缩小,膀胱内CD8 + T细胞浸润增加以及肿瘤浸润Treg细胞减少。此外,用抗PD-1和抗B7-H4抗体联合治疗可显著降低肿瘤分期,减小肿瘤大小并增加肿瘤坏死水平。这些发现表明,针对B7-H4的抗体可能是对PD-1检查点抑制剂无反应的膀胱癌患者的可行治疗策略。

摘要:

    免疫检查点阻断治疗已显著改善了诸多疾病(如黑色素瘤)的临床结果,但由于并非所有的患者都会从免疫治疗中获益,因此仍然需要预测性的生物标志物来确定谁将从哪种疗法中获益最多。截至目前,大多数的生物标志物主要来源于肿瘤本身,而由于外周血的易得性和可重复性,研究者们希望从外周血中寻找到更加理想的预测生物标志物。

    本研究中,为了寻找可预测抗CTLA-4和抗PD-1治疗反应的生物标志物,研究者基于一个包含约40个表面和胞内 Marker 的 panel,通过质谱流式细胞技术(CyTOF)来综合剖析了黑色素瘤患者的外周血。发现抗CTLA-4和抗PD-1治疗具有不同的治疗反应预测标志物。对于抗 CTLA-4 治疗,CD4+和CD8+的记忆/非记忆细胞以及其他记忆细胞亚群的分布在有响应和无响应患者中存在差别(图 1)。CD4+和CD8+ 记忆T细胞在响应抗CTLA-4治疗中起到了重要的作用,因此可作为潜在的预测生物标志物。而对于抗PD-1治疗而言,发现表达CD69和MIP-1β的NK细胞在有响应和无响应患者中存在差别(图 2)。这类功能活跃的NK细胞亚群很可能在由抗PD-1治疗触发的抗肿瘤响应中起到至关重要的作用。

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Distinct Predictive Biomarker Candidates for Response to Anti-CTLA-4 and Anti-PD-1 Immunotherapy in Melanoma Patients

SUMMARY

Abstract Background: While immune checkpoint blockade has greatly improved clinical outcomes in diseases such as melanoma, there remains a need for predictive biomarkers to determine who will likely benefit most from which therapy. To date, most biomarkers of response have been identified in the tumors themselves. Biomarkers that could be assessed from peripheral blood would be even more desirable, because of ease of access and reproducibility of sampling.

Methods: We used mass cytometry (CyTOF) to comprehensively profile peripheral blood of melanoma patients, in order to find predictive biomarkers of response to anti-CTLA-4 or anti-PD-1 therapy. Using a panel of ~ 40 surface and intracellular markers, we performed in-depth phenotypic and functional immune profiling to identify potential predictive biomarker candidates.

Results: Immune profiling of baseline peripheral blood samples using CyTOF revealed that anti-CTLA-4 and anti-PD-1 therapies have distinct sets of candidate biomarkers. The distribution of CD4+ and CD8+ memory/ non-memory cells and other memory subsets was different between responders and non-responders to anti- CTLA-4 therapy. In anti-PD-1 (but not anti-CTLA-4) treated patients, we discovered differences in CD69 and MIP-1β expressing NK cells between responders and non-responders. Finally, multivariate analysis was used to develop a model for the prediction of response.

Conclusions: Our results indicate that anti-CTLA-4 and anti-PD-1 have distinct predictive biomarker candidates. CD4+ and CD8+ memory T cell subsets play an important role in response to anti-CTLA-4, and are potential biomarker candidates. For anti-PD-1 therapy, NK cell subsets (but not memory T cell subsets) correlated with clinical response to therapy. These functionally active NK cell subsets likely play a critical role in the anti-tumor response triggered by anti-PD-1.

Cite as: Subrahmanyam et al. J Immunother Cancer, 2018.

摘要:

    动脉粥样硬化是由主动脉中促炎性和抗炎性白细胞的相互作用所驱动的一种慢性炎症性疾病。然而目前我们对于主动脉白细胞表型和转录多样性依然知之甚少。因此,研究人员通过单细胞RNA测序(scRNAseq)和质谱流式(CyTOF)深度表征了健康和动脉粥样硬化小鼠主动脉中的白细胞,来定义动脉粥样硬化的免疫细胞图谱。

    通过seRNAseq分析取自普通饲料和西方饮食喂养的 Apoe-/- 和 Ldlr-/- 小鼠的主动脉白细胞,研究者检测到动脉粥样硬化小鼠的样本中有11个主要的具有不同表型和空间特征的白细胞亚群,而健康的主动脉样本中的细胞类型则较少。通过单细胞水平的基因集合富集分析(Gene set enrichment analysis)建立了多条与白细胞相关的信号通路, 如脂代谢、增殖和细胞因子分泌通路,发现一些白细胞亚群在动脉粥样硬化 Apoe-/- 和 Ldlr-/- 小鼠中受到差异性的调节。研究者通过CyTOF,利用35个Marker的panel确认了这些亚群表型的多样性, 并且确认了CyTOF获得的分型结果与转录组定义的亚群高度相关。利用scRNAseq,CyTOF和流式分选进行综合分析,研究者检测到了3个主要的B细胞亚群在表面Marker、功能通路和体外细胞因子分泌方面发生了变化。随后,通过一种基因去卷积方法,基于白细胞基因特征,研究者进一步揭示了126个人类斑块中的白细胞占比。发现人颈动脉斑块和显微切割的小鼠斑块中的白细胞主要由巨噬细胞,T细胞和单核细胞组成。此外,颈动脉斑块中由基因定义的白细胞占比预测了患者心血管相关事件的发生。

    本研究说明通过高纬度分析来定义白细胞的多样性,使得我们可以对主动脉白细胞亚群进行精细的分析,进而揭示新的免疫学机制和细胞类型特异性通路,并且建立人动脉粥样硬化中白细胞的功能关联。

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Atlas of the Immune Cell Repertoire in Mouse Atherosclerosis Defined by Single-Cell RNA-Sequencing and Mass Cytometry

SUMMARY

Rationale: Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease that is driven by the interplay of pro- and anti-inflammatory leukocytes in the aorta. Yet, the phenotypic and transcriptional diversity of aortic leukocytes is poorly understood.

Objective: We characterized leukocytes from healthy and atherosclerotic mouse aortas in-depth by single-cell RNA- sequencing and mass cytometry (cytometry by time of flight) to define an atlas of the immune cell landscape in atherosclerosis.

Methods and Results: Using single-cell RNA-sequencing of aortic leukocytes from chow diet–and Western diet–fed Apoe?/?and Ldlr?/? mice, we detected 11 principal leukocyte clusters with distinct phenotypic and spatial characteristics while the cellular repertoire in healthy aortas was less diverse. Gene set enrichment analysis on the single-cell level established that multiple pathways, such as for lipid metabolism, proliferation, and cytokine secretion, were confined to particular leukocyte clusters. Leukocyte populations were differentially regulated in atherosclerotic Apoe?/?and Ldlr?/? mice. We confirmed the phenotypic diversity of these clusters with a novel mass cytometry 35-marker panel with metal-labeled antibodies and conventional flow cytometry. Cell populations retrieved by these protein-based approaches were highly correlated to transcriptionally defined clusters. In an integrated screening strategy of single-cell RNA-sequencing, mass cytometry, and fluorescence-activated cell sorting, we detected 3 principal B-cell subsets with alterations in surface markers, functional pathways, and in vitro cytokine secretion. Leukocyte cluster gene signatures revealed leukocyte frequencies in 126 human plaques by a genetic deconvolution strategy. This approach revealed that human carotid plaques and microdissected mouse plaques were mostly populated by macrophages, T-cells, and monocytes. In addition, the frequency of genetically defined leukocyte populations in carotid plaques predicted cardiovascular events in patients.

Conclusions: The definition of leukocyte diversity by high-dimensional analyses enables a fine-grained analysis of aortic leukocyte subsets, reveals new immunologic mechanisms and cell-type–specific pathways, and establishes a functional relevance for lesional leukocytes in human atherosclerosis.

Cite as: Winkels et al. Circ Res, 2018.

摘要:

通过对人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞的体外研究,人们已掌握明确的证据显示存在多种巨噬细胞极化状态。然而,在内稳态或在严重损伤状态(如急性呼吸窘迫综合征,ARDS)下存在的不同肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)的极化程度仍然不甚明了。本文研究者应用单细胞质谱流式细胞技术(CyTOF)来同时检测支气管肺泡灌洗液中的CD45+细胞上的36个细胞表面标记物,肺泡灌洗液分别取自健康人,以及患有ARDS和未患ARDS的进行机械呼吸的患者。通过t-SNE算法对高维数据进行可视化分析显示,在CD33+CD71+CD163+的肺泡巨噬细胞中,细胞表面标志物的表达具有很高的多样性。研究者随后利用kNN密度近似算法(κ-nearest neighbor density estimation algorithm)来识别不同的肺泡髓样细胞亚群,并通过CD169和PD-L1的表达情况定义了3个肺泡巨噬细胞亚群,且其中的一个肺泡巨噬细胞亚群占比在健康人和进行机械呼吸的患者中有显著的差别。此外,一组独立的ARDS队列研究显示,长期机械呼吸的患者和死亡患者的肺泡巨噬细胞上,PD-L1基因表达和PD-L1/PD-1通路相关的基因组表达显著减少。综上可得,对受试者肺泡白细胞的无监督CyTOF分析,有可能识别出可能与临床结果相关的预期的和潜在的新髓样细胞亚群。

Cytometry TOF identifies alveolar macrophage subtypes in acute respiratory distress syndrome

SUMMARY

Studies in human peripheral blood monocyte–derived macrophages in vitro have shown clear evidence that multiple macrophage polarization states exist. The extent to which different alveolar macrophage (AM) polarization states exist in homeostasis or in the setting of severe injury such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) is largely unknown. We applied single-cell cytometry TOF (CyTOF) to simultaneously measure 36 cell-surface markers on CD45+ cells present in bronchoalveolar lavage from healthy volunteers, as well as mechanically ventilated subjects with and without ARDS. Visualization of the high-dimensional data with the t-distributed stochastic neighbor embedding algorithm demonstrated wide diversity of cell-surface marker profiles among CD33+CD71+CD163+ AMs. We then used a κ-nearest neighbor density estimation algorithm to statistically identify distinct alveolar myeloid subtypes, and we discerned 3 AM subtypes defined by CD169 and PD-L1 surface expression.The percentage of AMs that were classified into one of the 3 AM subtypes was significantly different between healthy and mechanically ventilated subjects. In an independent cohort of subjects with ARDS, PD-L1 gene expression and PD-L1/PD-1 pathway–associated gene sets were significantly decreased in AMs from patients who experienced prolonged mechanical ventilation or death. Unsupervised CyTOF analysis of alveolar leukocytes from human subjects has potential to identify expected and potentially novel myeloid populations that may be linked with clinical outcomes.

Cite as: Morrell et al. JCI Insight, 2018.

摘要:

虽然目前免疫检查点治疗(immune-checkpoint therapy,ICT)的主要靶标是淋巴细胞,但事实上,治疗涉及到更广泛的肿瘤微环境重塑。本研究中,研究者通过互补的高维单细胞剖析,定义了在肿瘤自然生长或在有效的ICT期间,来自同源小鼠肿瘤的所有造血细胞的差异。通过单细胞RNA测序(scRNAseq)对肿瘤浸润细胞基因表达的客观评估,以及质谱流式(CyTOF)对细胞蛋白表达的纵向评估,研究者发现肿瘤内的淋巴细胞和髓系细胞均有明显的重塑现象。令人惊讶的是,研究者观察到多个单核/巨噬细胞亚群(可通过生物标志物CD206, CX3CR1, CD1d和iNOS来区分)在ICT过程中不断发生变化,且这些变化在某种程度上部分依赖于IFNg。研究数据说明这种巨噬细胞极化/激活是受到循环单核细胞和早期巨噬细胞进入肿瘤的影响,而非受到预极化的成熟瘤内巨噬细胞的影响。

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EHigh-Dimensional Analysis Delineates Myeloid and Lymphoid Compartment Remodeling during Successful Immune-Checkpoint Cancer Therapy

SUMMARY

Although current immune-checkpoint therapy (ICT) mainly targets lymphoid cells, it is associated with a broader remodeling of the tumor micro-environment. Here, using complementary forms of high-dimensional profiling, we define differences across all hematopoietic cells from syngeneic mouse tumors during unrestrained tumor growth or effective ICT. Unbiased assessment of gene expression of tumor-infiltrating cells by single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and longitudinal assessment of cellular protein expression by mass cytometry (CyTOF) revealed significant remodeling of both the lymphoid and myeloid intratumoral compartments. Surprisingly, we observed multiple subpopulations of monocytes/macrophages, distinguishable by the markers CD206, CX3CR1, CD1d, and iNOS, that change over time during ICT in a manner partially dependent on IFNg. Our data support the hypothesis that this macrophage polarization/activation results from effects on circulatory monocytes and early macrophages entering tumors, rather than on pre-polarized mature intratumoral macrophages.

Cite as: Gubin et al. Cell, 2018.

摘要:

耗竭性CD8 T细胞(Exhausted CD8 T cells,Tex)是慢性感染和癌症的免疫治疗靶标,但过去缺乏对于人疾病中Tex细胞多样性的综合评估。本研究中,研究者建立了一种转录组和表观基因组引导的质谱流式分析方法,来定义HIV和人类癌症中Tex细胞的核心耗竭特异性基因(Core exhaustion-specific genes)和疾病诱导的变化。基于单细胞蛋白质组学,通过表型、功能、转录因子和抑制受体的共表达模式的区别,研究者定义出了9种不同的Tex细胞亚群。随后,他们建立了一种衡量耗竭严重程度的指标,并与多维表型(High-dimensional phenotypes)结合,来识别健康组、慢性感染组和癌症组中与疾病严重程度相关并随HIV治疗变化的Tex细胞亚群。此外,还定义了将不同Tex细胞亚群作为免疫治疗靶标的组合模式。本文提到的方法和相关数据集为研究人Tex细胞生物学提供了资源,对慢性感染、自身免疫和癌症的免疫监测和免疫调节具有重要的意义。

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Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells

SUMMARY

Exhausted CD8 T (Tex) cells are immunotherapy targets in chronic infection and cancer, but a comprehensive assessment of Tex cell diversity in human disease is lacking. Here, we developed a tran- scriptomic- and epigenetic-guided mass cytometry approach to define core exhaustion-specific genes and disease-induced changes in Tex cells in HIV and human cancer. Single-cell proteomic profiling identified 9 distinct Tex cell clusters using phenotypic, functional, transcription factor, and inhibitory receptor co-expression patterns. An exhaustion severity metric was developed and integrated with high-dimensional phenotypes to define Tex cell clusters that were present in healthy subjects, common across chronic infection and cancer or enriched in either disease, linked to disease severity, and changed with HIV therapy. Combinatorial patterns of immunotherapy targets on different Tex cell clusters were also defined. This approach and associated datasets present a resource for investigating human Tex cell biology, with implications for immune monitoring and immunomodulation in chronic infections, autoimmunity, and cancer.

Cite as: Bengsch et al. Immunity, 2018.

摘要:

人记忆B细胞和边缘区(marginal zone,MZ)B细胞有着相似的特征,如都表达CD27,并且二者的IGHV和BCL6基因都具有体细胞突变。但两者之间的关系依然存在争议。在本研究中,研究者展现了淋巴组织中的细胞表型发展:MZ B细胞是通过与记忆细胞相差甚远的一种前体 CD27-CD45RBMEM55+ 亚群发育而来,在成熟 B细胞池中显现。通过质谱流式细胞技术,研究者发现MZ B细胞和记忆B细胞在肠道淋巴组织中占据着不同的微观解剖学龛(microanatomical niches)。虽然两者均在远端淋巴组织和血液之间广泛传播,并且两者在肠道生发中心(germinal centres,GC)均具有多种IGHV突变,但两者仍然在很大程度上克隆分离(即二者具有不同的发育路径)。因此,尽管MZ B细胞与经典记忆B细胞均能够通过肠道生发中心并从中获得体细胞突变,但MZ B细胞在发育上与经典记忆B细胞并不是相连或相似的。

Spatiotemporal segregation of human marginal zone and memory B cell populations in lymphoid tissue

SUMMARY

Human memory B cells and marginal zone (MZ) B cells share common features such as the expression of CD27 and somatic mutations in their IGHV and BCL6 genes, but the relationship between them is controversial. Here, we show phenotypic progression within lymphoid tissues as MZ B cells emerge from the mature B cell pool via a precursor CD27-CD45RBMEM55+ population distant from memory cells. By imaging mass cytometry, we find that MZ B cells and memory B cells occupy different microanatomical niches in organised gut lymphoid tissues. Both populations disseminate widely between distant lymphoid tissues and blood, and both diversify their IGHV repertoire in gut germinal centres (GC), but nevertheless remain largely clonally separate. MZ B cells are therefore not developmentally contiguous with or analogous to classical memory B cells despite their shared ability to transit through GC, where somatic mutations are acquired.

Cite as: Zhao et al. Nat Commun, 2018.

摘要:

流行病学数据表明,初生时期所暴露的环境是影响后期免疫介导性疾病的关键决定性因素。幼儿也特别容易受到感染,因此需要对生命早期的免疫系统发展进行更多分析。这类分析过去大多在小鼠模型或人脐带血样本上实施,但这些研究并未考虑到新生儿出生后暴露于复杂环境对其免疫系统的影响。我们采取了婴儿出生后最初三个月内的4个时间点样本,对100名新生儿的免疫系统进行了纵向研究分析。基于100μL血液,我们分别通过质谱流式细胞技术(mass cytometry,CyTOF)和免疫测定分析了58个免疫细胞亚群和267种血浆蛋白的发展情况,发现了脐带血检测无法预测的巨大变化并且这些变化遵循固定的模式。早产儿和足月儿出生时的免疫系统不同,但会逐渐发展汇聚到共同的轨迹上,这一发展模式似乎是由微生物相互作用驱动,并会被早期肠道细菌生态失调所阻碍。

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Stereotypic Immune System Development in Newborn Children

SUMMARY

Epidemiological data suggest that early life exposures are key determinants of immune-mediated disease later in life. Young children are also particularly susceptible to infections, warranting more analyses of immune system development early in life. Such analyses mostly have been performed in mouse models or human cord blood samples, but these cannot account for the complex environmental exposures influencing human newborns after birth. Here, we performed longitudinal analyses in 100 newborn children, sampled up to 4 times during their first 3 months of life. From 100 mL of blood, we analyze the development of 58 immune cell populations by mass cytometry and 267 plasma proteins by immunoassays, uncovering drastic changes not predictable from cord blood measurements but following a stereotypic pattern. Preterm and term children differ at birth but converge onto a shared trajectory, seemingly driven by microbial interactions and hampered by early gut bacterial dysbiosis.

Cite as: Olin et al. Cell, 2018.

摘要:

大多数的结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染无临床症状,即潜伏性结核感染,全世界约有四分之一人可能有潜伏性结核感染。虽然最终会发病的患者不到10%,但肺结核依然是全世界范围内,最为致命的传染病之一。尽管做了很多努力,我们对于这种疾病感染背后的免疫因素却知之甚少。在本研究中,我们通过多队列的综合研究分析了Mtb感染不同阶段的宿主反应。首先,我们通过质谱流式技术和功能研究对南非青少年的外周血进行了分析研究。我们发现潜伏性结核感染与增强的细胞毒性反应有关,细胞毒性反应主要由CD16(即 FcγRⅢa)和自然杀伤细胞调控。此外,持续的炎症会影响到T细胞和B细胞。随后,我们对不同年龄、遗传背景、地域和感染阶段队列的转录组数据进行了细胞类型反卷积算法分析,发现虽然外周B细胞和T细胞通常会在潜伏期就发生变化,且在不同的队列间存在差异性。但是,在所有的研究队列中,循环自然杀伤细胞数量均会在感染潜伏期增加,在发病期相应的减少,并在临床治愈后回升到正常水平。通过进一步对三组队列的纵向研究,我们发现外周自然杀伤细胞数量的变化能够反映出疾病进展和治疗反应情况,并且与肺结核患者的肺部炎症状态呈负相关。综上,我们的研究结果为结核病潜伏期的潜在病理生理学提供了重要的见解,同时寻找到了可能影响感染预后的关键因素。

参考文献:

Roy Chowdhury R, Vallania F, Yang Q, et al. A multi-cohort study of the immune factors associated with M. tuberculosis infection outcomes. Nature, 2018.

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摘要:

目的:钇90微球栓塞放射疗法(Y90-RE)能够显著减少局部晚期肝细胞癌并减缓疾病进展。本研究的目的在于深度分析Y90-RE对免疫系统的影响,获得持久的治疗反应。
思路:利用飞行时间质谱(CyTOF)和二代测序技术描绘Y90-RE治疗前后不同时间点,肿瘤浸润白细胞(TILs)、肿瘤组织和外周血单核细胞(PBMCs)的免疫图谱。
结果:经Y90-RE治疗后,TILs呈现出局部免疫活化的信号:颗粒酶(GB)、CD8+ T细胞、CD56+ NK细胞和CD8+CD56+ NKT细胞表达增高。二代测序证实了经Y90-RE治疗的肿瘤中,涉及固有免疫和适应性免疫活化的基因表达上调。涉及CCL5和CXCL16的趋化路径与活化的GB + CD8 + T细胞向经Y90-RE处理的肿瘤处聚集相关。对比Y90-RE治疗前后的PBMCs,我们观察到,治疗后CD8+和CD4+的T细胞分泌的TNF-α均增加,且抗原提呈细胞的占比也有所增加,反映出系统性的免疫活化现象。有趣的是,共表达归巢受体CCR5和CXCR6的PD-1+/Tim-3+CD8+ T细胞的占比很高,意味着对Y90-RE有治疗响应。基于对预处理外周血的免疫分析,我们建立了一个预测模型来寻找对Y90-RE有持久疗效的患者。
结论:对肿瘤的高维分析和对免疫细胞的系统性分析发现了与Y90-RE持续性治疗反应相符的局部和系统性的免疫活化现象。找到了与积极的临床治疗反应相关的潜在生物标志物,并建立了一个预测模型,可以在治疗前预测Y90-RE是否能对患者产生持久疗效。

参考文献:

Chew V, Lee YH, Pan L, et al. Immune activation underlies a sustained clinical response to Yttrium-90 radioembolisation in hepatocellular carcinoma. Gut, 2018.

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摘要:

已有一些研究表明中枢神经系统(CNS)中含有多种免疫细胞,在组织稳态、免疫防御和神经性疾病中扮演着不同的角色。描绘整个大脑中的免疫细胞图谱是一件极具挑战的工作,尤其是对于病变的脑组织而言,由于组织中同时存在表型改变的细胞和来源于血液的细胞,想要清晰地区分活性免疫细胞亚群变得十分困难。本研究中,我们采用高维单细胞质谱流式技术(CyTOF)、流式细胞技术并结合基因标记的原基分布图(genetic fate mapping)对哺乳动物CNS中多种不同的免疫细胞亚群进行了识别、定位和描述。通过这一方法,我们揭示了CNS中同时稳定存在着小胶质细胞、多种脑屏障附近的巨噬细胞亚群和树突细胞。此外,我们发现在衰老的过程中以及在阿兹海默模型和多种硬化症中,CNS免疫微环境会发生疾病特异性的改变。综上,本研究提供了一种研究方法和框架,可应用于CNS疾病,疾病机理、潜在生物标记物(biomarkers)以及治疗靶标的研究。

参考文献:

Pavlovic A, Hartmann FJ, Merkler D, et al. High-Dimensional Single-Cell Mapping of Central Nervous System Immune Cells Reveals Distinct Myeloid Subsets in Health, Aging, and Disease. Immunity, 2018.

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摘要:

中性粒细胞是一种固有免疫细胞,由于中性粒细胞的半衰期短,因此需要增殖的骨髓前体细胞不断地分化补充。虽然人们已经明确中性粒细胞是由粒-巨噬祖细胞(GMP)发育而来,但是从GMP发育至功能化的成熟中性粒细胞的分化路径依然未被明确定义。利用质谱流式细胞技术(CyTOF)和细胞周期分析,我们确认了骨髓中存在的三种中性粒细胞亚群:一种增殖的中性粒前体细胞(preNeu),以及其分化的不增殖的未成熟中性粒细胞和成熟的中性粒细胞。转录组学剖析和功能分析揭示,preNeu从GMP发育而来以及其继续分化的过程中需要C/EBPε转录因子,此外,当preNeu成熟后,其增殖能力会被迁移和效应功能所替代。在败血症和荷瘤小鼠体内,preNeu会在病菌和肿瘤的刺激下扩增。在荷瘤小鼠体内,肿瘤周边和血液中的未成熟中性粒细胞含量增高。综上,我们的研究发现了在内稳态和应激反应下保证细胞补给的特异性骨髓粒细胞亚群。

参考文献:

Evrard M, Kwok IWH, Chong SZ, et al. Developmental Analysis of Bone Marrow Neutrophils Reveals Populations Specialized in Expansion, Trafficking, and Effector Functions. Immunity, 2018.

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摘要:

组蛋白的转录后修饰和染色质组蛋白变体间的替换几乎是调控所有DNA 模板化生物过程的核心环节。但是,关于人类免疫细胞染色质修饰的程度和多样性依然知之甚少。本研究中,我们采用了一种高通量的质谱流式细胞技术从单细胞层面全面剖析了人主要免疫细胞各水平的染色质修饰状况。我们的数据显示,免疫细胞具有亚群特异的染色质修饰特征,此外,淋巴来源和骨髓来源的免疫细胞也具有各自特异的染色质修饰特征。对比年轻人和老年人的染色质修饰情况发现,染色质修饰在个体和细胞间的差异性均随着年龄的增长而增加。随后通过对双胞胎群体的研究,发现上述与衰老相关的染色质改变主要是由非遗传因素驱动的。综上,我们展示了一种强大的染色质和免疫学的研究方法。本研究的发现突出体现了衰老对于染色质修饰的深远影响。

参考文献:

Cheung P, Vallania F, Warsinske HC, et al. Single-Cell Chromatin Modification Profiling Reveals Increased Epigenetic Variations with Aging. Cell, 2018.

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摘要:

在关于癌症复发的研究中,需要进一步寻找分析哪些癌细胞亚群对疾病的复发起到决定性的作用。我们在此发表了一项关于前体B细胞急性淋巴白血病的单细胞研究,揭示了与B急淋复发相关的一些分化阶段依赖性的细胞信号。通过质谱流式细胞技术,我们同时定量分析了来自60个初诊样本中与B细胞不同发育阶段相关的35个marker。每一个白血病B细胞随后被匹配至与其发育阶段最为接近的健康B细胞亚群。通过机器学习,我们识别出了6个白血病B细胞亚群特征,能够在诊断时有效预测病人是否会复发。其中,一种pro-BII亚群(具有活化的mTOR信号)和一种pre-BI亚群(具有活化的和无响应的pre-B受体信号)与白血病的复发相关。我们将这一预测模型命名为“发育依赖性复发预测模型”(developmentally dependent predictor of relapse,DDPR),该模型能够明显改善现有的风险分级方法。在诊断时发现的DDPR特征将持续存在至复发阶段。通过数据驱动的方法,我们证明了单细胞“组学”在转化医学中对病人风险分级预测的价值,并提供了其在人类癌症研究领域中的应用框架。

参考文献:

Jager A, Samusik N, Aghaeepour N, et al. Single-cell developmental classification of B cell precursor acute lymphoblastic leukemia at diagnosis reveals predictors of relapse. Nat Med, 2018.

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摘要:

免疫检查点阻断是一种革命性的癌症疗法。尤其是PD-1抑制剂,已经被证明对治疗转移性黑色素瘤和一些其他癌症有效。虽然抗PD-1治疗极大地增加了无进展生存期,但仍有相当一部分的患者并未获得持久的疗效。因此,迫切需要寻找到可以预测临床疗效的生物标志物。本研究中,我们通过高维度的单细胞质谱流式技术和一系列的生物信息学分析,对IV期黑素瘤患者在抗PD-1治疗前和治疗后12周的外周血样本进行了深度的免疫细胞亚群分析。我们在经过治疗的患者中观察到了对免疫治疗有明显响应的T细胞亚群。此外,发现了单核细胞亚群CD14+CD16-HLA-DRhi的含量可以在治疗前有效预测患者对抗PD-1治疗的无进展和总体生存期。我们随后通过独立、盲选入组的流式细胞检测验证了上述结果。因此,我们认为上述这一单核细胞亚群在外周血中的含量有可能为临床决策提供指导性的建议。

参考文献:

Krieg C, Nowicka M, Guglietta S, et al. High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy. Nat Med, 2018.

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摘要:

由于肿瘤新生抗原特异性T细胞(tumor neoantigen-specific T cells)较少,对荷瘤个体的肿瘤新生抗原特异性CD8+ T细胞的分析具有挑战性。在本研究中,我们展示了质谱流式结合多重组合的四聚体染色能够识别和表征荷瘤小鼠(3-甲基胆蒽诱发肉瘤的小鼠,对检查点阻断免疫疗法敏感)的新生抗原特异性CD8+ T 细胞。 在所测试的81种候选的抗原中,我们同时在荷瘤小鼠的肿瘤、脾脏和淋巴结中识别出了限定为两种已知新生抗原的T细胞。高维表型剖析揭示,抗原特异性的肿瘤浸润性T细胞具有高度的异质性。进一步研究表明,新生抗原特异性的肿瘤浸润性T细胞在经抗CTLA-4或抗PD-1免疫治疗后的小鼠中显示出不同的表现谱,而它们的外周新生抗原特异性T细胞未受到治疗的影响。我们的结果洞见了新生抗原特异性T细胞的性质以及检查点阻断免疫疗法的影响。

Checkpoint Blockade Immunotherapy Reshapes the High-Dimensional Phenotypic Heterogeneity of Murine Intratumoural Neoantigen-Specific CD8+ T Cells

SUMMARY

The analysis of neoantigen-specific CD8+ T cells in tumour-bearing individuals is challenging due to the small pool of tumour neoantigen-specific T cells. Here we show that mass cytometry with multiplex combinatorial tetramer staining can identify and characterize neoantigen-specific CD8+ T cells in mice bearing T3 methylcholanthrene-induced sarcomas that are susceptible to checkpoint blockade immunotherapy. Among 81 candidate antigens tested, we identify T cells restricted to two known neoantigens simultaneously in tumours, spleens and lymph nodes in tumour-bearing mice. High-dimensional phenotypic profiling reveals that antigen-specific, tumour-in?ltrating T cells are highly heterogeneous. We further show that neoantigen-specific T cells display a different phenotypic profile in mice treated with anti-CTLA-4 or anti-PD-1 immunotherapy, whereas their peripheral counterparts are not affected by the treatments. Our results provide insights into the nature of neoantigen-specific T cells and the effects of checkpoint blockade immunotherapy.

Cite as: Fehlings et al. Nat Commun, 2017.

摘要:

免疫检查点阻断能够在一部分患者中实现持久的反应。然而,对于抗CTLA-4和抗PD-1诱导肿瘤排斥的潜在机制,我们的理解尚未尽如人意。针对上述问题,我们利用质谱流式技术全面地剖析了免疫检查点阻断对人黑色素瘤和小鼠肿瘤模型中肿瘤浸润免疫细胞的影响。本研究中的分析显示不同的肿瘤模型中存在着一个高度相似的肿瘤浸润性T细胞亚群谱图,说明检查点阻断仅针对某些特定的肿瘤浸润性T细胞亚群。抗PD-1主要诱发特定的耗竭样CD8肿瘤浸润性T细胞(tumor-infiltrating exhausted-like CD8 T cells)的表达,而抗CTLA-4除了诱发特定的耗竭样CD8 T细胞亚群的表达,还会引发一种ICOS+ Th1样CD4效应T细胞亚群(ICOS+ Th1-like CD4 T cells)的表达。综上,我们的发现说明抗CTLA-4和抗PD-1免疫检查点阻断诱发的免疫响应是由不同的细胞机制所驱动的。

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Distinct Cellular Mechanisms Underlie Anti-CTLA-4 and Anti-PD-1 Checkpoint Blockade

SUMMARY

Immune-checkpoint blockade is able to achieve durable responses in a subset of patients; however, we lack a satisfying comprehension of the underlying mechanisms of anti-CTLA-4- and anti-PD-1-induced tumor rejection. To address these issues, we utilized mass cytometry to comprehensively profile the effects of checkpoint blockade on tumor immune infiltrates in human melanoma and murine tumor models. These analyses reveal a spectrum of tumor-infiltrating T cell populations that are highly similar between tumor models and indicate that checkpoint blockade targets only specific subsets of tumor-infiltrating T cell populations. Anti-PD-1 predominantly induces the expansion of specific tumor-infiltrating exhausted-like CD8 T cell subsets. In contrast, anti-CTLA-4 induces the expansion of an ICOS+ Th1-like CD4 effector population in addition to engaging specific subsets of exhausted-like CD8 T cells. Thus, our findings indicate that anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint-blockade-induced immune responses are driven by distinct cellular mechanisms.

Cite as: Wei et al. Cell, 2017.

摘要:

为了指导肺癌早期患者免疫治疗方案的设计,研究者通过CyTOF技术对早期腺癌患者进行了多参数的免疫分析,以期找到肿瘤诱发的免疫变化。该研究还利用barcoding方法同时对肿瘤组织、正常肺组织和外周血进行了CyTOF分析,由此勾勒出了详细的早期肺癌免疫细胞图谱。免疫图谱分析发现了 Ⅰ 期(Stage Ⅰ tumors)肺腺癌病变部位已经发生明显改变的T细胞和NK细胞亚型。此外,该研究还确定了某些肿瘤浸润性髓系细胞(TIM)亚群可能扰乱抗肿瘤T细胞的活性。该研究通过CyTOF对免疫系统的单细胞分析,得到了肿瘤诱导的免疫变化的有效信息,说明CyTOF是帮助合理设计免疫治疗方案的强大工具。

参考文献:

Lavin Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell, 2017.

该文章的重要发现有望帮助判断开始癌症治疗的最佳时间,进而开发出更精准的癌症免疫疗法,被Cell评为2017年度十大最佳论文。

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摘要:

免疫应答包括不同细胞和组织间的协调作用。但以往关于肿瘤免疫治疗的研究,主要聚焦于肿瘤微环境的局部免疫应答。为了更加全面地研究免疫活性,我们利用质谱流式细胞技术剖析了转基因肿瘤小鼠模型整个机体的免疫反应。我们通过可视化的单细胞数据分析模型,分析了在免疫治疗后几种组织中的免疫应答情况。有效的免疫治疗不仅快速触发了肿瘤部位的免疫响应还触发了全身性的免疫响应。但在肿瘤抑制的过程中,只有外周免疫细胞能够维持增殖。在几种免疫治疗模型中,全身性的免疫应答在组织间协调,是根除肿瘤的必要条件。此外,我们证实了一种外周 CD4+T 细胞亚群能够阻止新的肿瘤产生并且会在响应免疫疗法的患者中显著扩增。这些研究说明全身性的免疫应答对于肿瘤的抑制有着十分重要的影响。

参考文献:

Spitzer MH, Carmi Y, Reticker-Flynn NE, et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell, 2017.

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摘要:

树突状细胞(DC)是专职抗原提呈细胞,能够协调免疫应答。人的DC细胞包含两种功能不同的细胞系:浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DCs, pDC)和经典树突状细胞(conventional DCs, cDC),这两种细胞的起源和分化途径目前仍不明朗。在本研究中,我们结合了两种高维度单细胞技术——单细胞mRNA测序和质谱流式细胞技术(CyTOF),来分析人血中的CD123+CD33+CD45RA+ DC前体细胞(pre-DC)。pre-DC与pDC虽然共享相同的表面marker,却具有不同的功能特性,而在过去,这些特性都被归属于pDC。跟踪DC细胞从骨髓分化至外周血的路径发现,pre-DC有着不同功能和表型的亚群,包括早期不符合分化的CD123high pre-DC亚群以及两种符合分化的CD45RA+CD123low亚群。多种不同功能pre-DC亚群的发现为DC亚群特异性靶向治疗开辟了新途径。

参考文献:

See P, Dutertre CA, Chen J, et al. Mapping the human DC lineage through the integration of high-dimensional techniques. Science, 2017.

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摘要:

炎症性肠道疾病的特征在于异常的免疫反应并且影响胃肠道的不同位置。虽然一些免疫细胞亚群在肠道致病过程中起到的作用已经被研究,但是缺乏在单细胞层面同时对所有主要的免疫细胞谱系进行系统性的分析方法。我们通过质谱流式细胞技术对健康人和患者的肠道粘膜免疫系统进行了系统性的全面分析。我们区分出了142种免疫细胞亚群,并通过计算机分析在PBMCs和肠组织中找到了能够区别患者和健康人的免疫细胞亚群。此外,发现了与疾病高度相关的不同细胞亚型,使得粘膜淋巴恶性肿瘤以及可能发展成为粘膜淋巴恶性肿瘤的前体能被轻易地检测到。这些研究发现说明,对整个免疫系统进行综合的高维度分析能够识别出与复杂肠道疾病的发病机理相关的免疫细胞亚群。同时说明该分析方法在肠道疾病和肠道粘膜恶性肿瘤的诊断、免疫监视和治疗中可能具有潜在的应用价值。

参考文献:

Van Unen V, Li N, Molendijk I, et al. Mass Cytometry of the Human Mucosal Immune System Identifies Tissue- and Disease-Associated Immune Subsets. Immunity, 2016.

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摘要:

CD4+T细胞在自身病理性免疫中起到了关键的作用。然而,在特定的自身免疫性疾病中定义其关键效应群功能仍然具有挑战性。致病性CD4+T细胞可通过目标组织中近期激活标志物的表达来鉴定。本研究通过质谱流式细胞技术分析类风湿关节炎患者关节组织中活化的T细胞,发现类风湿关节炎患者滑膜中PD-1hiCXCR5-CD4+细胞显著增加。这群细胞尽管PD-1表达高,但并不属于耗竭性细胞。我们使用多维流式细胞技术(质谱流式)、转录组学和功能实验,定义了PD-1hiCXCR5-外周辅助T(TPH)细胞群体,这类细胞亚群能够表达B细胞辅助因子,包括IL-21、CXCL13、ICOS和MAF。与PD-1hiCXCR5+滤泡辅助细胞类似,TPH细胞通过IL-21分泌和SLAMF5相互作用诱导体外浆细胞分化。随后,全转录组学发现了TPH细胞和T滤泡辅助细胞之间的差异,包括TPH细胞中BCL6和BLIMP1的表达改变,以及趋化因子受体介导向炎症位置迁移,如CCR2、CX3CR1和CCR5。TPH细胞似乎能特异性地促进病理性炎症非淋巴组织中B细胞应答和抗体产生。

参考文献:

Rao DA, Gurish MF, Marshall JL, et al. Pathologically expanded peripheral T helper cell subset drives B cells in rheumatoid arthritis. Nature, 2017.

摘要:

拓宽我们对于外源性Ags诱导或扰乱的B细胞亚群的丰度和表型的认知,有助于改善疫苗的评估程序。质谱流式技术(CyTOF)能够增加被应用于单细胞研究的marker的数量,因此在描绘与分析细胞表型特征方面能够达到史无前例的高度。本文中,研究者设计了一个质谱流式Panel,来比较食蟹猴在接种疫苗前(基线)以及接受改性牛痘病毒Ankara第二次注射后的第8和28天,其体内的B细胞反应。并通过SPADE算法来识别CD20+ B细胞群体。

研究数据揭示:稳态的循环B细胞具有表型复杂性和多样性,同时观察到,一些B细胞亚群中,一定比例的细胞受疫苗诱导产生了显著的变化。所有的SPADE亚群(包括在数量上因接种疫苗而改变的亚群)通过表现型表征并用双层聚类(double hierarchical clustering)进行比较。疫苗改变的亚群包括前文提到的CD27hiCD21lo 激活的记忆B细胞和CD27+ CD21+ 休眠的记忆B细胞,以及由新的marker共表达组合区分出的细胞亚型。此外,单个记忆B细胞SPADE亚群的扩张,之后收缩,与血清抗疫苗抗体的滴度呈正相关。通过非线性随机嵌入算法(nonlinear stochastic embedding)基于细胞的表达进行自动分类也能得到相似的结果。

综上,本文的研究者利用了一种CyTOF数据的两步聚类分析方法,深度表征了疫苗接种前后B细胞的亚型和占比。这一方法适用于纵向研究及B细胞亚群或生物标志物的发现。

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Identification of Vaccine-Altered Circulating B Cell Phenotypes Using Mass Cytometry and a Two-Step Clustering Analysis

SUMMARY

Broadening our understanding of the abundance and phenotype of B cell subsets that are induced or perturbed by exogenous Ags will improve the vaccine evaluation process. Mass cytometry (CyTOF) is being used to increase the number of markers that can be investigated in single cells, and therefore characterize cell phenotype at an unprecedented level. We designed a panel of CyTOFAbs to compare the B cell response in cynomolgus macaques at baseline, and 8 and 28 d after the second homologous immunization with modified vaccinia virus Ankara. The spanning-tree progression analysis of density-normalized events (SPADE) algorithm was used to identify clusters of CD20+ B cells. Our data revealed the phenotypic complexity and diversity of circulating B cells at steady- state and significant vaccine-induced changes in the proportions of some B cell clusters. All SPADE clusters, including those altered quantitatively by vaccination, were characterized phenotypically and compared using double hierarchical clustering. Vaccine-altered clusters composed of previously described subsets including CD27hiCD21lo activated memory and CD27+CD21+ resting memory B cells, and subphenotypes with novel patterns of marker coexpression. The expansion, followed by the contraction, of a single memory B cell SPADE cluster was positively correlated with serum anti-vaccine Ab titers. Similar results were generated by a different algorithm, automatic classification of cellular expression by nonlinear stochastic embedding. In conclusion, we present an in-depth characterization of B cell subphenotypes and proportions, before and after vaccination, using a two-step clustering analysis of CyTOF data, which is suitable for longitudinal studies and B cell subsets and biomarkers discovery.

Cite as: Pejoski et al. J Immunol, 2016.

摘要:

为了在单细胞水平分析细胞重编程过程,通过CyTOF(mass cytometry)同时检测了贯穿重编程过程不同时间点的细胞上的各种生物标志物,包括与细胞多能性、细胞分化、细胞周期和细胞信号相关的生物标志物。之后对所得数据集进行时间相关的进展分析,构建了三个独立的重编程细胞系的连续分子路径图。虽然三个细胞系Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc的表达水平不同,但三者呈现出一套共同的重编程标志。在重编程过程的早期,Oct4high Klf4high细胞转变为CD73high CD104high CD54low部分重编程状态。来源于这一中间状态亚群的Ki67low细胞会恢复回MEF样表型,而Ki67high细胞亚群则进一步发育为M-E-T,之后分化为两个不同的亚群:ESC样Nanoghigh Sox2high CD54high亚群和中内胚层样Nanoglow Sox2low Lin28high CD24high PDGFR-ahigh亚群。本研究中开发出的时间分辨的,单细胞水平的进展分析方法可能应用于更加复杂及动态变化的体系,如癌症进展和胚胎发育过程。

参考文献:

Zunder ER, Lujan E, Goltsev Y, et al. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell, 2015.

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摘要:

流式细胞术是剖析造血系统功能复杂性的一种基本工具。我们使用单细胞“质谱流式”检测健康人骨髓,对每个细胞同时进行了34个参数的检测(包括31种抗体,细胞活力,DNA含量,和相对细胞大小)。通过体外刺激和抑制剂干扰,同时标记18个功能性信号状态,监测骨髓造血系统细胞亚群的异常信号行为。所得数据,根据细胞表面抗原表达,经算法分析对细胞进行聚类分型,并提供抑制剂药物刺激前后细胞信号的叠加对比谱图。以这种可视化方式,分析基于细胞表面标记定义的细胞亚群中先前未被发现的胞内即刻信号通路反应和随后的蛋白磷酸化反应。总的来说,这样的单细胞分析使我们能够系统性地分析健康人造血系统中的免疫信号,进而通过对比分析药物作用与疾病状态来进行药物干预和机制研究。

参考文献:

Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science, 2011.

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